Esclerosis Múltiple: Las células gliales progenitoras remielinizan efectivamente cerebro adulto

Las células gliales progenitoras remielinizan efectivamente cerebro adulto

Windrem, M. S.; Schanz, S. J.; Zou, L.; et al

Cell Reports. 2020; 3
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107658
Open Access

Human Glial Progenitor Cells Effectively Remyelinate the Demyelinated Adult Brain

Resumen

Células progenitoras gliales humanas trasplantadas neonatalmente (hGPC) pueden mielinizar cerebros de ratones shiverer con deficiencia de mielina, rescatando su fenotipo y supervivencia. Sin embargo, no ha quedado claro si los hGPC implantados son capaces de remielinizar SNC adulto difusamente desmielinizado. Investigamos si las hGPC podrían remielinizar tanto los triturados adultos congénitos hipomielinizados, como a ratones adultos normales después de la desmielinización con cuprizona. En trituradores adultos, las hGPC se dispersan ampliamente y se diferencian como oligodendrocitos mielinizantes después de la inyección subcortical, mejorando tanto la conducción en cuerpo calloso como la marcha. Los hGPC implantados vuelven a mielinizar de manera similar axones desnudos después de desmielinización con cuprizona; ya sea que se haya administrado antes o después de la desmielinización. La secuenciación de ARN de las hGPC de cerebros desmielinizados con cuprizona, revela la activación transcripcional de programas de diferenciación de oligodendrocitos, al tiempo que los distingue de las hGPC no expuestas previamente a desmielinización. Estos datos indican la capacidad de las hGPC trasplantadas para dispersarse por todo el SNC adulto y mielinizar regiones afectadas, y para ser reclutados como oligodendrocitos mielinogénicos bajo demanda asociada a desmielinización.

Introducción

Los oligodendrocitos son la única fuente de mielina en SNC adulto, su pérdida o disfunción está en la base de una amplia variedad de enfermedades en niños y adultos. En niños, las leucodistrofias hereditarias acompañan a la parálisis cerebral como fuentes principales de morbilidad asociada a desmielinización. En adultos, la desmielinización contribuye no solo a enfermedades diversas como la esclerosis múltiple (EM), el accidente cerebrovascular (ACV) de sustancia blanca y una amplia variedad de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. Como resultado, las enfermedades desmielinizantes (ED) se han convertido en blancos atractivos para estrategias terapéuticas basadas en células. Otros estudios han establecido la capacidad de células progenitoras gliales humanas (hGPC) trasplantadas neonatalmente, también denominadas indistintamente como células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) o células NG2. Además, una variedad de preparaciones enriquecidas en hGPC, derivadas tanto de cerebro humano y células stem pluripotentes, han mostrado ser capaces de remielinizar lesiones focales de cerebro adulto y médula espinal, aunque estudios posteriores se realizaron en modelos focales. No es claro si la hGPCs son capaces de migrar extensamente in tejido cerebral adulto, como sería necesario para reparar tejidos extensamente desmielinizado. En nuestro conocimiento, no hubo estudios sistemáticos verificados sobre la capacidad de hGPCs para migar dentro o remielinizar tejido cerebral desmielinizado adulto.

Preguntamos si hGPcs derivada de cerebro fetal podría exhibir migración y expansión en medio adulto para servir como agente terapéutico. En este sentido recientes investigaciones apoyan la rapidez con la cual los axones pueden remielinizar después de desmielinización congénita o en el adulto en presencia de células mielogénicas. Otros reportes resaltaron la pérdida de mielinización celular por células gliales progenitoras en desórdenes tan diversos como la Corea de Huntington y EM. Se investigó si el hGPCs administrado directamente en cerebro podría remielinizar axones. Se utilizaron tres paradigmas experimentales distintos. En el primero se investigó si el hGPCs podría dispersarse dentro de la mielina cerebral adulta de ratones MBPshi/shi, que portan la mutación “podadora” el gen que codifica la proteína básica de mielina (MBP). En el segundo, verificamos si el hGPC injertado podría responder a la desmielinización inducida por cuprizona generando oligodendrocitos y mielinizando axones Tercero, verificamos si hGPCs transplantado a cerebro adulto, luego de desmielinizar con cuprizona, podrían remielinizar axones desnudos, como podría anticiparse en el tratamiento basado en células de trastornos con EM progresiva.

En las 3 experiencias el hGPCs; tanto injertado en forma neonatal o trasplantado en adultos, efectivamente se dispersa en cerebro anterior, diferenciando oligodendroglía y reparando axones desmielinizados. Aislamos hGPCs de cerebros quimerizados neonatales luego de desmielinización por cuprizona y usamos secuenciación de RNA (RNA-seq), para definir los genes inducidos por desmielinización con cuprizona. Los datos sugieren que hGPCs podría remielinizar lesiones desmielinizadas constituyéndose en interesante blanco molecular

Resultados

Ratones shiverer adultos exhiben mielinización después del parto con hGPC

Para evaluar la capacidad de hGPC de donantes para dispersarse y diferenciarse como oligodendroglía en cerebro adulto, introdujimos hGPC fetal clasificadas con CD140a a ratones shiverer adultos 3 rag2/inmunodeficientes, así como en dos líneas control de inmunodeficiencia normalmente mielinizadas, a saber, rag1/en fondo C57BL/6 y rag2/ en C3H. Todos los ratones fueron inyectados después del destete, en el rango de 4 a 12 semanas de edad; Todos los shiverers fueron inyectados entre 4 y 6 semanas. Un total de 22 ratones (8 shiverers y 14 ratones desnudos normalmente mielinizados, tanto rag1 / como rag2 /) fueron inyectados bilateralmente en cuerpo calloso (CC), con inyecciones de hGPCs por hemisferio. Los 8 shiverers y 6 de los controles fueron sacrificados 12-15 semanas más tarde, y los 8 ratones control restantes fueron sacrificados aproximadamente al año de edad. Se examinaron los cerebros de todos los ratones para determinar la dispersión de las células del donante y la diferenciación oligodendrocítica, así como la inmunorreactividad de MBP, que necesariamente derivaba del donante en el contexto de trituración.

Ratones trituradores adultos exhiben mielinización luego de liberación de hGPC

Se introdujo hGPC fetales clasificadas con CD140a en ratones shiverer jóvenes 3 rag2/inmunodeficientes, así como en dos líneas de control de inmunodeficiencia normalmente mielinizadas, a saber rag1/ en un fondo C57BL/6 y rag2/en C3H. Todos los shiverers fueron inyectados entre 4 y 6 semanas. Un total de 22 ratones (8 shiverers y 14 ratones desnudos normalmente mielinizados, tanto rag1/ como rag2 /) fueron inyectados bilateralmente en cuerpo calloso (CC), con inyecciones de 5,3 x 104 hGPCs por hemisferio. Los 8 shiverers y 6 de los controles fueron sacrificados 12-15 semanas más tarde, y los 8 ratones de control restantes fueron sacrificados aproximadamente al año de edad. Se examinaron los cerebros de todos los ratones para determinar la dispersión de las células del donante y la diferenciación oligodendrocítica, así como la inmunorreactividad de MBP, que necesariamente se derivaba del donante en el contexto de trituración.

Las hGPC fueron altamente migratorias y mielinógenas en cerebro adulto. A las 12-15 semanas después del trasplante, las células inyectadas se habían dispersado ampliamente por todo el cerebro anterior, como se observa típicamente en recién nacidos tratados de manera similar, con una distribución casi uniforme de células donantes notadas en toda la sustancia blanca en ratones shiverers y ratones normalmente mielinizados. La mielinogénesis fue robusta con mielinización densa en cuerpo calloso. Es importante destacar que las densidades callosas de todas las células humanas, así como hGPC, oligodendrocitos y astrocitos, fueron significativamente más altas en los cerebros receptores que en la mielina de tipo salvaje (WT), lo que indica la ventaja competitiva de células donantes humanas. En los cerebros control WT, ya sea examinados a los 5 ó 12 meses, estas células también se expandieron e injertaron, permanecieron en gran medida como progenitores. Estos datos indicaron que las hGPC clasificadas por CD140a pueden migrar ampliamente por todo el cerebro del ratón adulto joven, que la dispersión de estas células no se ve obstaculizada por el parénquima cerebral adulto y la mielinización robusta de axones aún viables puede comenzar incluso después de varios meses de ausencia de mielina madura en cerebro afectado.

La mielinización mediada por progenitores se asoció con mejora funcional

Se trasplantó una cohorte de ratones shiverer 3 rag2/ratones con un total de 4 x 105 hGPC, administrados al cuerpo calloso y cuerpo estriado bilateralmente; se inyectó una cohorte emparejada de shiverers. Los ratones fueron evaluados a las 18-20 semanas para: (1) función motora, por análisis en cinta de correr; (2) amplitudes y velocidades de conducción transcallosa, determinado por amplitud de potenciales de acción; y (3) análisis microscópicos confocales y electrónicos de la mielina derivada de donantes.

A las 18 semanas, la función motora y la deambulación de los ratones shiverer trasplantados habían mejorado frente a los controles no trasplantados: entre una muestra de 8 ratones tratados y 8 controles, solo 2 de 8 controles no tratados pudieron permanecer en la cinta en movimiento durante el período mínimo de prueba de 5 segundos. Las mejoras asociadas al trasplante se asociaron con normalización, en relación con ratones WT, en la amplitud del componente N1 (fibra mielinizada grande) del potencial de acción del compuesto transcallosal, según lo evaluado en el corte de secciones coronales. Además, los cortes derivados de cerebros trasplantados exhibieron aumento significativo en la velocidad de conducción del cuerpo calloso.

Esto se reflejó en la latencia del componente N2, mientras que los ratones no tratados tenían una velocidad de N2 de 305.2 ± 6.4 m/s, y cortes derivados de trasplantados (con análisis restringido a aquellos con un componente N1 medible) manifestaron una velocidad más lenta a N2 de 285.5 ± 10.7 m / s (p = 0.02 por ANOVA unidireccional; F = 4.07, 73 df), que era indistinguible de la de los controles WT myelin WT (283.9 ± 4.0 m / s). Además, el análisis ultraestructural confirmó que los shiverer injertados con hGPC desarrollaron mielina compacta al momento del sacrificio y formación de líneas densas mayores.

Las hGPC residentes pueden remielinizar cuerpo calloso desmielinizado por cuprizona

La cuprizona es un quelante de cobre, cuya administración oral crónica causa disfunción mitocondrial que es más precoz y más prominente en los oligodendrocitos citolíticos. Su administración oral resulta en una desmielinización difusa, relativamente sincrónica, que se ha caracterizado bien en una variedad de cepas y edades de ratones. La desmielinización inducida por cuprizona es más reproducible que cualquier otro modelo de desmielinización, se asocia con poca lesión axonal aguda o pérdida neuronal, y es relativamente no inflamatoria, excepto por la activación microglial local. Para evaluar la capacidad de las hGPC de remielinizar axones adultos recién desmielinizados, se utilizó cuprizona para inducir desmielinización central y seguimos las respuestas de las hGPC residentes y las introducidas posteriormente a esa pérdida de mielina.

Comenzamos preguntando si los hGPC que ya residen dentro de la materia blanca del ratón podrían diferenciarse como oligodendrocitos y remielinizar axones desnudos después del desafío con cuprizona. Primero evaluamos los efectos de la cuprizona en ratones C57BL/6 rag1/3 y confirmamos observaciones previas que en 12 semanas de cuprizona se induce la pérdida generalizada de la transferrina (TF) en oligodendrocitos del cuerpo calloso, sin pérdida detectable de GPC residente de ratón. Luego preguntamos si los hGPC implantados neonatalmente podrían tolerar de manera similar la exposición a la cuprizona y se comprobó que era capaz de remielinizar axones, previamente mielinizados, afectados por cuprizona.

Programas de transcripción estereotípicos activados por hGPC después de la desmielinización con cuprizona

A continuación, preguntamos si la desmielinización y su activación concomitante de hGPC se asociaba con eventos transcripcionales que podrían identificar los determinantes tempranos de la movilización de células progenitoras, así como los del destino astrocítico u oligodendrocítico. Para identificar de ese modo las respuestas de hGPC a la desmielinización in-vivo, se aislaron cerebros quiméricos desmielinizados con cuprizona en los que habían residido desde el nacimiento, mediante el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia dirigida por CD140a (FACS), seguido de ARN- seq. Se trasplantaron rag1/ratones neonatos con hGPC fetal. En ese punto, los ratones control continuaron con una dieta normal, mientras que los ratones experimentales pasaron a una dieta de cuprizona al 0.2% durante 12 semanas para inducir la muerte oligodendrocítica. A los ratones desmielinizados con cuprizona se les permitió recuperarse durante 12 semanas adicionales en condiciones normales. Ambos grupos fueron sacrificados a las 36 semanas de edad. La sustancia blanca callosa fue disecada y disociada; los CDG140a+ hGPC fueron aislados por FACS. El ARN de estos aislados de hGPC fue extraído y secuenciado. El principal componente del análisis muestras normalizadas de RNA-seq reveló muestras de agrupación estrecha de control (CTR), que como grupo se distinguieron de sus contrapartes post-cuprizona. Tanto las hGPC post-cuprizona como las CTR se enriquecieron para genes asociados con linaje oligodendroglial temprano; incluidos CNP, GPR17, NKX2-2, OLIG1, OLIG2, SOX10, CSPG4 y ST8SIA1, así como el marcador de selección PDGFRA/CD140a). En contraste, los aislados de hGPC exhibieron una expresión de baja a indetectable de varios marcadores de células madre neurales, progenitoras neurales, marcadores endoteliales, microgliales, neuronales y astrocíticos. Sin embargo; aunque ambos grupos se presentaron previamente con firmas transcripcionales consistentes con el fenotipo hGPC, un total de 914 transcripciones fueron expresadas diferencialmente entre hGPCs después de la recuperación del tratamiento con cuprizona y sus contrapartes control (ajustado p <0.05). De estos, 777 genes estaban regulados positivamente en GPC tratados con cuprizona, mientras que 137 estaban regulados negativamente. El análisis funcional de este conjunto de genes demostró que las hGPC tratadas con cuprizona expresaron de forma diferencial las ontologías de genes que reflejan la proliferación celular, el hallazgo de la ruta y el movimiento celular, y el inicio de la nación de mielina.

El análisis de red reveló que las hGPC expuestas a cuprizona fueron preparadas para la oligoneogénesis

La red incluyó 43 términos funcionales significativamente enriquecidos y relevantes, además de sus genes contribuyentes expresados diferencialmente. La detección de la comunidad de genes por análisis de modularidad se llevó a cabo para agregar funciones y genes estrechamente relacionados. Este análisis arrojó cuatro módulos distintos (M1 – M4), que identificaron individualmente distintos procesos asociados con inicio de remielinización por hGPC movilizados por la desmielinización de cuprizona.

M1 reveló que las hGPC que se recuperan de la desmielinización de cuprizona regula notablemente su expresión de genes asociados a mielinogénesis, incluidos MOG, MOBP y CLDN11. Además, varios genes previamente marcados como inducidos durante diferenciación y remielinización de oligodendrocitos también fueron regulados al alza; estos genes incluyeron ST18, PLEKHA1 y CMTM5, junto con los que se consideran necesarios para la maduración adecuada de oligodendrocitos: CERS2, LPAR1, GSN, KIF14, CNTN2, ST3GAL3 y WASF1 / WAVE1. Curiosamente, M1 reveló además que la señalización TCF7L2, un importante impulsor de la mielinización, también está fuertemente regulada al alza en la remielinización de hGPC. Los genes que contribuyen a la migración y al hallazgo de la ruta de los GPC también se regularon positivamente después de la exposición a cuprizona; estos genes incluyeron ROBO1 y los coreceptores de semaforina clase 3 NRP2 y PLXNA3.

Dentro de M2, se observó que varios factores de transcripción y efectores de señal asociados vitales para el movimiento y la diferenciación de oligodendrocitos se enriquecieron significativamente en las hGPC postcuprizona. Estos incluyeron SMAD4, factor de crecimiento transformante b (TGF-b) y NOTCH, así como los genes promielinogénicos SMAD7, PAK3 y NOTCH3. Por el contrario, el inhibidor de la diferenciación de la vía Notch JAG1 fue reprimido bruscamente, lo que sugiere la diferenciación incipiente de estas células. También localizado en este módulo y regulado al alza en GPC remielinizantes fue GPR37, cuya expresión asiste y es necesaria para la diferenciación de oligodendrocitos. Curiosamente, CIP2A, un represor transcripcional de GPR37, estaba profundamente disminuido en las hGPC movilizadas por cuprizona, lo que nuevamente sugiere que la desmielinización de cuprizona desencadena la desinhibición activa de la diferenciación oligodendrocítica por hGPC parenquimatosas previamente inactivas.
M3 consistió en varias categorías funcionales fuertemente involucradas en la mielinización. Estas incluyen transcripciones involucradas en transporte y la absorción de hormona tiroidea y L-triyodotironina-9. En M3 también incluyeron genes asociados con señalización de retinoides, particularmente RXRA y del complejo receptor de retinoides RARG, cuya regulación al alza se observó en hGPC después de cuprizona. Esto es de significación; ya que esta familia se ha vinculado no solo a la mielinización del desarrollo, sino también a la remielinización. M3 también incluyó genes asociados con la absorción de colesterol y lípidos, procesos críticos para la mielinización.

El cuarto módulo incluía genes asociados con el transporte y regulación del hierro y otros cationes multivalentes. El hierro es importante en la regulación de la diferenciación oligodendrocítica y la mielinización. En este sentido, se observó una regulación al alza de MON1A y FXN, genes asociados al metabolismo de hierro desregulados en lesiones de esclerosis múltiple. De manera similar, notamos que genes que codifican proteínas reguladoras de calcio asociadas con la maduración de la mielina, que incluían CASR, GSN y TRPC3, también aumentaron en hGPC después de desmielinización por cuprizona; al igual que transcripciones involucradas en la señalización de AMP-cíclico (cAMP), otro modulador de la diferenciación de oligodendrocitos, en parte por diafonía con GPR37 y GPR17.
En general, el patrón de expresión diferencial de genes hGPC expuestas a la zona cuprígida parece definir una red de expresión típica de remielinización derivada de progenitores tempranos. Como tales, estos datos indican que cuando se movilizaron en respuesta a desmielinización por cuprizona, las hGPC activaron un conjunto de programas transcripcionales que sirvieron para dirigir tanto la diferenciación oligodendrocítica como la mielogénesis. Además, las muchas vías expresadas diferencialmente que operan en estas hGPC, en relación con aquellas que no habían sufrido una exposición previa a cuprizona y la movilización inducida por desmielinización, sugieren que las hGPC residentes en un entorno de desmielinización crónica, adquieren patrones transcripcionales que pueden distinguir su competencia funcional y destino potencial del de las células progenitoras gliales residentes vírgenes.

Discusión

La inyección intracerebral de hGPC en ratones shiverer neonatos shiverer en dispersión generalizada de células donantes humanas, seguida de su diferenciación oligodendrocítica y mielogénesis. Esto conduce a mielinización completa o casi completa de cerebro, tronco encefálico y médula espinal del receptor, con rescate clínico de una gran proporción de ratones trasplantados.
En adultos, la pérdida oligodendrocítica contribuye a enfermedades tan diversas como pérdida de materia blanca hipertensiva y diabética; lesión espinal traumática de médula espinal y cerebro, la EM y sus variantes; incluso la pérdida de materia blanca relacionada con edad en demencias subcorticales. Todas estas condiciones son objetivos potenciales de terapia de reemplazo con células progenitoras gliales, reconociendo que el entorno de la enfermedad en adultos, puede limitarse este enfoque a maneras específicas de la enfermedad. Del mismo modo, los entornos de enfermedades inflamatorias tipo EM, así como de muchas leucodistrofias, presentan sus propios desafíos, que deben superarse antes que la remielinización basada en células pueda tener éxito. Estos incluyen participación de GPC movilizados en respuesta inflamatoria. No obstante, las estrategias actuales de modificación de enfermedad del tratamiento de enfermedades vasculares y autoinmunes, han avanzado hasta el punto en que a menudo se puede lograr la estabilización del entorno de la enfermedad; de modo que la remielinización basada en trasplantes para la reparación estructural de la materia blanca adulta desmielinizada pueda ser factible.

A pesar de las preocupaciones sobre la capacidad de células progenitoras gliales de remielinizar axones en entornos de enfermedades, como la EM y la leucomalacia periventricular en la parálisis cerebral; varios estudios han señalado la naturaleza intrínseca de las células de bloqueo de diferenciación oligodendrocítica en esos casos. Por lo tanto, se podría esperar que los hGPC vírgenes recién introducidos, ejerzan una competencia de diferenciación y mielinización sin restricciones en cerebros del huésped y; como tales, puedan remielinizar axones previamente desmielinizados. Para definir la competencia de las hGPC para remielinizar axones cuando se administran al cerebro adulto, se usaron dos fenotipos antigénicos de GPC; respectivamente definidos como CD140a+ y A2B5+/PSA-NCAM, cada uno derivado de tejido cerebral humano fetal. Estos fenotipos son en gran parte pero no completamente homólogos; El fenotipo CD140a es la fracción principal del grupo A2B5+ /PSA-NCAM. En cada uno de estos sistemas modelo, los hGPC trasplantados restauraron efectivamente la mielina en cerebro del huésped. El diseño de este experimento tenía la intención de imitar lo que se podría encontrar en el tratamiento postnatal de una leucodistrofia hipomielinizante, y la efectiva dispersión y mielinización de las células progenitoras. Del mismo modo, la diferenciación de oligodendrocitos derivados de hGPC y la remielinización axonal de los donantes, demostraron ser fuertes en respuesta a la desmielinización por cuprizona. Este último conjunto de experimentos, proporcionó una importante prueba de principios, mostrando que las hGPC podían remielinizar axones que ya habían sido mielinizados en el pasado y que luego fueron desmielinizados en el contexto de pérdida de oligodendrocitos; Precisamente, tal situación podría anticiparse en trastornos como la EM progresiva, en la que se puede esperar que la remielinización de axones residuales desnudos confiera beneficio funcional.

De hecho, en cada uno de esos paradigmas experimentales, se notó que las hGPC; sea injertadas neonatalmente o trasplantadas en adultos, se dispersaron efectivamente en cerebro anterior, incluso en ratones normalmente mielinizados, y se diferenciaron como oligodendroglía y lesiones mielinizadas desmielinizadas a medida que evolucionaban o eran encontrados.
Una vez establecido el potencial de las hGPC como vectores mielinogénicos, utilizamos el ARN-secuencia de hGPC extraídas de cerebros en los que habían residido durante la exposición a cuprizona para evaluar la respuesta transcripcional de estas células a la desmielinización y la remielinización inicial. Encontramos que los hGPC movilizados expresaron una firma transcripcional consistente con la remielinización temprana. En consecuencia, observamos una serie de vías activadas en hGPC desencadenadas por desmielinización; estas incluyen una serie de gestores de elección y diferenciación oligodendroglial, que incluían TCF7L2, TGF-b/SMAD4 y vías impulsadas por NOTCH. La activación de cada una de estas vías estaba vinculada a la desinhibición de la diferenciación asociada a la desmielinización por estos hGPC parenquimatosos, cuya maduración oligodendrocítica permitió la remielinización compensatoria. Juntos, estos estudios establecen una lógica operativa para evaluar la capacidad de hGPC de remielinizar lesiones desmielinizadas de cerebro humano adulto; al tiempo que proporcionan un conjunto prometedor de objetivos moleculares para la modulación de este proceso en células de cerebros humanos que habían residido durante la exposición cuprizona para evaluar la respuesta transcripcional de estas células a la desmielinización y remielinización inicial. Encontramos que los hGPC movilizados expresaron una firma transcripcional consistente con la remielinización temprana. En consecuencia, observamos una serie de vías activadas en hGPC desencadenadas por desmielinización que no se habían observado previamente en modelos de desmielinización murina. La activación de cada una de esas vías estaba vinculada a desinhibición de la diferenciación asociada a la desmielinización por estos hGPC parenquimatosos, cuya maduración oligodendrocítica permitió la remielinización compensatoria de los axones desnudos. Juntos, estos estudios establecen una lógica operativa para evaluar la capacidad de las hGPC para remielinizar lesiones desmielinizadas del cerebro humano adulto, al tiempo que proporcionan un conjunto prometedor de objetivos terapéuticos moleculares para la modulación de este proceso en células humanas.